Sangue e hematopoiese

1. O sangue

1.1. Funções e composição

O sangue é um tecido conjuntivo especializado, em que os elementos figurados (células e fragmentos celulares, como as plaquetas) estão suspensos numa matriz extracelular líquida, o plasma. Funções:

• transporte: oxigénio e dióxido de carbono, nutrientes, produtos do metabolismo, hormonas, células de defesa;
• regulação: temperatura corporal, equilíbrio ácido-base, equilíbrio osmótico;
• defesa (leucócitos, anticorpos, complemento) e hemostase (plaquetas e fatores da coagulação).

O plasma é constituído por água (90 a 92 %), proteínas (7 a 8 %) e sais inorgânicos (cerca de 0,9 %: Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, Cl^{-}, HCO_{3}^{-}), além de nutrientes, vitaminas, hormonas, produtos do metabolismo e gases dissolvidos.

O soro é a fração líquida obtida após a coagulação e separação do coágulo. Está essencialmente desprovido de fibrinogénio; alguns fatores da coagulação são consumidos ou reduzidos, mas não desaparecem todos. Conserva numerosas outras proteínas plasmáticas.

1.2. Hematócrito

Quando o sangue, com um anticoagulante, é centrifugado, separa-se em três camadas:

• uma camada fina, esbranquiçada, de leucócitos e plaquetas (buffy coat, camada leucoplaquetária), com cerca de 1 %;
• o plasma por cima.

Os valores de referência variam com o sexo, a idade e o laboratório. Um hematócrito baixo pode ocorrer na anemia ou na hemodiluição; um valor alto pode refletir aumento da massa eritrocitária ou diminuição do plasma, como na desidratação. Interpreta-se em conjunto com a concentração de hemoglobina e o contexto clínico.

1.3. Observação do sangue

O sangue observa-se em esfregaços corados com misturas do tipo Romanowsky (eosina e azul de metileno, mais os azures que resultam da sua oxidação), como as colorações de Wright, Giemsa ou May-Grünwald-Giemsa. A técnica do esfregaço foi descrita no capítulo 1. Os grânulos azurófilos coram de púrpura com os azures; os grânulos específicos de cada leucócito têm cores características.

2. Eritrócitos

Os eritrócitos (glóbulos vermelhos) transportam oxigénio e dióxido de carbono. No ser humano são discos bicôncavos, anucleados e sem organelos, com cerca de 7,5 µm de diâmetro e 2 µm de espessura na periferia (0,8 µm no centro). Há 4 a 5,5 milhões por mm³.

• A forma bicôncava aumenta a superfície em relação ao volume e diminui a distância de difusão de qualquer ponto do citoplasma à superfície, o que acelera as trocas gasosas. No esfregaço dá a palidez central.
• O citoplasma é cheio de hemoglobina, por isso acidófilo. Tem também anidrase carbónica.
• Como não tem mitocôndrias, obtém energia por glicólise anaeróbia.
• Um citoesqueleto de espectrina, ligado à membrana, dá-lhe grande flexibilidade: deforma-se para passar em capilares com diâmetro inferior ao seu.
• A forma depende da osmolaridade do meio: num meio hipotónico incha e rebenta (hemólise); num meio hipertónico enruga-se (crenação).
• Vive 100 a 120 dias; os eritrócitos envelhecidos são fagocitados pelos macrófagos, sobretudo no baço, na medula óssea e no fígado.

A hemoglobina é formada por quatro cadeias polipeptídicas, cada uma com um grupo heme com ferro (Fe^{2+}), que liga uma molécula de O_{2}. No adulto predomina a hemoglobina A (duas cadeias α e duas β); no feto, a hemoglobina F (duas α e duas γ), com maior afinidade para o oxigénio. O CO_{2} é transportado sobretudo como bicarbonato. A anidrase carbónica eritrocitária catalisa a sua hidratação; grande parte do bicarbonato passa para o plasma em troca de cloreto, pelo transportador banda 3. Outra fração liga-se a grupos amino da hemoglobina (carbamino-hemoglobina) e uma fração menor permanece dissolvida.

Os reticulócitos são eritrócitos recém-libertados da medula, que ainda têm polirribossomas, mitocôndrias e restos de Golgi. Com colorações supravitais (azul de cresilo brilhante), o RNA precipita numa rede (reticulum). Representam cerca de 1 % dos eritrócitos e amadurecem em 24 a 48 horas. A sua contagem avalia a atividade da medula: aumentam após uma hemorragia ou na recuperação de uma anemia.

Anemia falciforme Uma mutação pontual na cadeia β da hemoglobina (hemoglobina S) faz com que, desoxigenada, a hemoglobina polimerize e deforme o eritrócito em foice. Os eritrócitos falciformes perdem flexibilidade, obstruem a microcirculação (crises vaso-oclusivas dolorosas) e são destruídos precocemente (anemia hemolítica).

3. Leucócitos

3.1. Classificação

Os leucócitos são células de defesa. Muitos usam o sangue como via de transporte e atravessam a parede vascular, sobretudo de vénulas pós-capilares (diapedese), para atuar nos tecidos; os linfócitos também recirculam entre compartimentos. Há cerca de 4000 a 10 000 por mm³, com valores de referência dependentes da população e do laboratório. Classificam-se pelos grânulos citoplasmáticos:

• Granulócitos: têm grânulos específicos (secundários), próprios de cada tipo, e grânulos azurófilos (primários), que são lisossomas. O núcleo é lobado (polimorfonucleares). São os neutrófilos, eosinófilos e basófilos.
• Agranulócitos: têm só grânulos azurófilos. O núcleo não é lobado (mononucleares). São os linfócitos e os monócitos.

3.2. Neutrófilos

São os leucócitos mais numerosos. O núcleo tem três a cinco lóbulos unidos por pontes finas de cromatina (polimorfonucleares); nas mulheres, um pequeno apêndice em baqueta de tambor corresponde ao cromossoma X inativo. Os neutrófilos jovens, com núcleo em forma de banda ou ferradura, ainda não segmentado, chamam-se neutrófilos em banda (bastonetes).

O citoplasma tem dois tipos de grânulos:

• específicos, pequenos, numerosos, menos densos, de cor rosa-lilás pálida, com enzimas que degradam a matriz extracelular (colagenase) e substâncias antibacterianas (lisozima, lactoferrina);
• azurófilos, maiores e mais densos, com mieloperoxidase, hidrolases ácidas e defensinas.

São os principais fagócitos da inflamação aguda. Chegam primeiro aos locais de infeção bacteriana, fagocitam as bactérias e matam-nas com as enzimas dos grânulos e com espécies reativas de oxigénio. Têm vida funcional relativamente curta e muitos morrem nos tecidos. Nas inflamações supurativas, a acumulação de neutrófilos, microrganismos e detritos pode formar pus.

3.3. Eosinófilos

O núcleo do eosinófilo é tipicamente bilobado, por vezes trilobado. O citoplasma tem grandes grânulos específicos eosinófilos, laranja-avermelhados. Ao microscópio eletrónico, apresentam frequentemente um cristaloide central (internum) rico em proteína básica principal (MBP), rodeado pela matriz (externum). Os grânulos contêm também ECP, peroxidase eosinofílica, neurotoxina derivada dos eosinófilos, histaminase, fosfatase ácida e outras enzimas; a ECP não deve ser atribuída indistintamente ao cristaloide.

Os eosinófilos atuam contra determinados parasitas, sobretudo helmintas, libertando proteínas citotóxicas dos grânulos. Podem internalizar algumas partículas ou complexos imunitários, mas não são fagócitos especializados como os neutrófilos. Participam também na inflamação alérgica: enzimas como a histaminase degradam mediadores, mas outros produtos podem amplificar a inflamação e lesar tecidos, como em formas de asma. O seu número pode aumentar (eosinofilia) em parasitoses e alergias.

3.4. Basófilos

São os leucócitos mais raros. O núcleo é oval, lobado ou em forma de S, muitas vezes tapado pelos grânulos. Os grânulos específicos são grandes e muito basófilos (azul-escuro a púrpura), metacromáticos, com heparina, histamina e fator quimiotático dos eosinófilos.

Os basófilos têm recetores para a porção Fc da IgE. A ligação do antigénio às IgE fixas provoca a desgranulação e a libertação de histamina e outros mediadores, que participam nas reações anafiláticas (hipersensibilidade imediata). Partilham origem hematopoiética e mecanismos de ativação por IgE com os mastócitos, mas seguem vias de diferenciação distintas: os basófilos amadurecem na medula e circulam no sangue; os mastócitos completam a maturação nos tecidos. Distinguem-se também na morfologia e nos marcadores moleculares.

3.5. Linfócitos

Os linfócitos pequenos (6 a 8 µm, pouco maiores que um eritrócito) têm núcleo esférico com cromatina condensada e um anel fino de citoplasma basófilo, com poucos organelos e grânulos. Os médios e grandes (até cerca de 18 µm) têm mais citoplasma: podem corresponder a células ativadas ou a subpopulações naturalmente maiores, como grandes linfócitos granulares NK e alguns T citotóxicos. O tamanho isolado não demonstra ativação.

3.6. Monócitos

Os monócitos são os maiores leucócitos. Têm núcleo único, oval ou reniforme (em forma de rim ou ferradura), excêntrico, com cromatina menos condensada do que a do linfócito. O citoplasma é abundante, azul-acinzentado, com grânulos azurófilos finos (lisossomas). O Golgi fica na indentação do núcleo.

Os monócitos integram o sistema fagocítico mononuclear. Circulam durante cerca de um a três dias e podem migrar para os tecidos, originando macrófagos que fagocitam, produzem citocinas e apresentam antigénios. Nem todos os macrófagos residentes derivam continuamente de monócitos adultos: várias populações estabelecem-se na embriogénese e mantêm-se por autorrenovação local, como a micróglia e populações de células de Kupffer e de Langerhans. Os osteoclastos resultam da diferenciação e fusão de precursores monocíticos/macrofágicos.

4. Plaquetas

As plaquetas (trombócitos) são fragmentos anucleados do citoplasma dos megacariócitos da medula óssea. São discos ovais biconvexos, com 2 a 4 µm; há 150 000 a 400 000 por mm³ e vivem cerca de 10 dias.

No esfregaço têm duas zonas:

• Granulómero, central, mais escuro (púrpura), com grânulos: grânulos α (fibrinogénio, fator de von Willebrand, fator de crescimento derivado das plaquetas), grânulos densos (ADP, serotonina, Ca^{2+}) e lisossomas; mitocôndrias e glicogénio.
• Hialómero, periférico, mais claro (azul pálido), com o citoesqueleto: uma banda marginal de microtúbulos, que mantém a forma discoide, e filamentos de actina e miosina, para a contração.

Têm ainda dois sistemas de membranas: o sistema canalicular aberto, invaginações da membrana que aumentam a superfície e por onde é libertado o conteúdo dos grânulos; e o sistema tubular denso, que armazena e liberta Ca^{2+}.

As plaquetas participam na hemostase. Após lesão vascular, aderem ao subendotélio exposto, com ligação do fator de von Willebrand ao complexo plaquetário GPIb-IX-V e participação de recetores do colagénio. A ativação altera a forma e liberta grânulos, recrutando outras plaquetas. A GPIIb/IIIa (integrina αIIbβ3) ativada liga fibrinogénio, que faz pontes entre plaquetas e permite a agregação no rolhão. A superfície plaquetária favorece a coagulação, que o estabiliza com fibrina. A contração plaquetária contribui para a retração do coágulo.

5. Hematopoiese

5.1. Células hematopoiéticas

A hematopoiese forma as células do sangue a partir de células estaminais hematopoiéticas (HSC), com autorrenovação e multipotência hematopoiética. A expressão tradicional «pluripotente» refere-se aqui às diferentes linhagens sanguíneas, não à pluripotência embrionária. No modelo clássico distinguem-se:

1. Células estaminais hematopoiéticas: mantêm o reservatório por autorrenovação e originam as linhagens sanguíneas.
2. Progenitores comuns mieloides e linfoides: potencial progressivamente restringido. O progenitor mieloide comum é também designado CFU-GEMM (granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos).
3. Progenitores comprometidos, como CFU-E, CFU-GM e CFU-Meg: funcionalmente definidos, em geral não identificáveis só pela morfologia.
4. Precursores reconhecíveis morfologicamente: blastos e fases subsequentes de maturação.
5. Células maduras, com características próprias da linhagem.

A diferenciação restringe o potencial de desenvolvimento; nas fases terminais de muitas linhagens cessa a divisão. Este esquema é uma simplificação didática, não a descrição de uma divisão obrigatória que produz exatamente duas células distintas.

5.2. Períodos hematopoiéticos

A hematopoiese muda de local durante o desenvolvimento:

• Período mesoblástico (a partir da 3.ª semana): ilhéus sanguíneos no saco vitelino; formam-se eritrócitos nucleados.
• Período hepático (a partir da 6.ª semana, máximo no 3.º a 5.º mês): sobretudo no fígado, com participação do baço.
• Período mieloide (a partir do 4.º a 5.º mês e toda a vida pós-natal): na medula óssea.

5.3. Medula óssea

A medula óssea ocupa o canal medular dos ossos longos e as cavidades do osso esponjoso. Há dois tipos:

• Medula amarela: predomínio de adipócitos e atividade hematopoiética muito reduzida. Substitui progressivamente a vermelha nas diáfises a partir da infância e pode sofrer reconversão em situações de maior necessidade, como anemia grave.

A medula vermelha é um tecido mole, gelatinoso, muito vascularizado e celular, com dois compartimentos:

• compartimento vascular: capilares sinusoides largos, de endotélio descontínuo e lâmina basal incompleta, que recolhem as células maduras;
• compartimento hematopoiético: cordões de células hematopoiéticas entre os sinusoides, sustentados por um estroma de células reticulares e fibras reticulares (colagénio III), com macrófagos e adipócitos. As células do estroma produzem os fatores que regulam a hematopoiese.

Na descrição histológica clássica, não se identifica uma rede de vasos linfáticos na medula. A localização de vasos linfáticos intraósseos continua discutida em investigação com técnicas tridimensionais e de rastreio celular; não deve ser inferida de um corte convencional.

As funções da medula vermelha são a produção das células do sangue, o armazenamento de ferro (nos macrófagos, como ferritina e hemossiderina), a destruição de eritrócitos envelhecidos e, por ser um órgão linfoide primário, a maturação dos linfócitos B.

5.4. Eritropoiese

A eritropoiese demora cerca de uma semana. A sequência é CFU-E → pró-eritroblasto → eritroblasto basófilo → eritroblasto policromático → eritroblasto ortocromático → reticulócito → eritrócito. Ao longo dela, três alterações progressivas permitem identificar as fases:

1. a célula e o núcleo diminuem de tamanho;
2. a cromatina condensa-se cada vez mais, até ao núcleo picnótico, que é expulso;
3. o citoplasma passa de basófilo (muitos ribossomas) a acidófilo (hemoglobina acumulada); na fase intermédia, a mistura das duas cores dá um tom acinzentado (policromatofilia).

Os eritroblastos agrupam-se à volta de um macrófago, formando ilhéus eritroblásticos: o macrófago fornece ferro e fagocita os núcleos expulsos.

A eritropoietina (EPO) é o principal regulador hormonal da eritropoiese, produzida predominantemente no rim em resposta à hipoxia. Promove sobrevivência, proliferação e diferenciação de progenitores eritroides. Fatores de suporte precoces incluem IL-3 e GM-CSF; a IL-9 também favoreceu subpopulações de BFU-E humanas em cultura, na presença de EPO, não devendo ser equiparada ao regulador hormonal principal. Aumenta na hipoxia, nas grandes altitudes e após hemorragia ou hemólise. Necessita de ferro, de vitamina B12 e de ácido fólico: a falta de ferro dá anemia microcítica; a falta de B12 ou de ácido fólico, que são necessários à síntese de DNA, dá anemia megaloblástica.

5.5. Granulopoiese

A granulopoiese forma neutrófilos, eosinófilos e basófilos a partir de progenitores mieloides. A CFU-GM origina sobretudo neutrófilos e monócitos; eosinófilos e basófilos têm progenitores comprometidos próprios. A sequência neutrofílica, em cerca de duas semanas, é mieloblasto → promielócito → mielócito → metamielócito → neutrófilo em banda → neutrófilo segmentado. As outras linhagens têm fases comparáveis, reconhecíveis pelos grânulos específicos a partir do mielócito. O que muda:

1. o núcleo indenta-se, alonga-se e, por fim, segmenta-se;
2. aparecem primeiro os grânulos azurófilos (no promielócito) e depois os grânulos específicos (a partir do mielócito), que permitem distinguir as três linhagens;
3. a célula deixa de se dividir a partir do metamielócito.

A medula guarda uma grande reserva de neutrófilos maduros, que é mobilizada rapidamente numa infeção. Por isso, numa infeção bacteriana aumentam no sangue os neutrófilos e, entre eles, os em banda (desvio à esquerda). A granulopoiese é estimulada pelo G-CSF (neutrófilos), pelo GM-CSF e, para os eosinófilos, pela IL-5.

5.6. Monocitopoiese e linfopoiese

• Monocitopoiese: CFU-GEMM → CFU-GM → CFU-M → monoblasto → promonócito → monócito. Os monócitos podem originar macrófagos nos tecidos, sobretudo na renovação e inflamação; várias populações residentes têm origem embrionária e autorrenovação local.
• Linfopoiese: progenitores linfoides → linfoblasto → prolinfócito → linfócito, na descrição morfológica tradicional. As fases de maturação e seleção funcional não se distinguem todas no esfregaço. Os precursores T completam maturação no timo e os B na medula óssea. A ativação e proliferação após reconhecimento antigénico ocorrem sobretudo nos órgãos linfoides secundários (baço, gânglios e tecido linfoide das mucosas).

5.7. Trombopoiese

A sequência é CFU-Meg → megacarioblasto → megacariócito → plaquetas. A endomitose aumenta o conteúdo de DNA por ciclos sem citocinese completa: são frequentes 16n e 32n, com valores superiores, incluindo 64n ou 128n, em algumas células. O megacariócito é das maiores células medulares (40 a 100 µm), com núcleo volumoso multilobado e citoplasma abundante e granuloso. Desenvolve um extenso sistema de membranas de demarcação e emite prolongamentos proplaquetários através da parede dos sinusoides. A remodelação e fragmentação destes, favorecida pelo fluxo sanguíneo, liberta milhares de plaquetas. A trombopoietina, produzida principalmente no fígado, é o regulador principal.

5.8. Fatores de crescimento hematopoiéticos

Alguns destes fatores são usados como fármacos: a eritropoietina na anemia da insuficiência renal e o G-CSF para recuperar os neutrófilos após quimioterapia.

- Eritrócito: disco bicôncavo, anucleado, 7,5 µm, 120 dias; reticulócito com restos de RNA. - Neutrófilo (multilobado, fagocitose), eosinófilo (bilobado, grânulos laranja, parasitas), basófilo (grânulos azul-escuro, histamina), linfócito (núcleo redondo, pouco citoplasma), monócito (núcleo reniforme, dá macrófagos). - Plaquetas: fragmentos de megacariócitos; granulómero e hialómero. - Eritropoiese: a célula diminui, o núcleo condensa e é expulso, o citoplasma passa de basófilo a acidófilo. - Granulopoiese: azurófilos no promielócito, específicos a partir do mielócito; núcleo reniforme no metamielócito.

6.1. Esfregaço de sangue, coloração de Wright

Esfregaço de sangue por picada do dedo, corado com eosina, azul de metileno e azures. Identificar:

• eritrócitos, a grande maioria, sem núcleo, com palidez central;
• neutrófilos, com núcleo de três a cinco lóbulos e grânulos finos pálidos;
• eosinófilos, com núcleo bilobado e grânulos grandes laranja;
• basófilos, raros, com grânulos azul-escuro que tapam o núcleo;
• linfócitos pequenos e grandes, com núcleo redondo e escuro;
• monócitos, grandes, com núcleo reniforme e citoplasma acinzentado;
• plaquetas, pequenos fragmentos púrpura, muitas vezes em grupos.

6.2. Medula óssea humana, biópsia da crista ilíaca, Giemsa ou H&E

Fixação em Bouin e descalcificação por EDTA. A medula óssea fica entre as trabéculas ósseas do osso esponjoso. As células hematopoiéticas agrupam-se em cordões entre adipócitos (locas brancas redondas) e sinusoides de parede mal definida, muitos com eritrócitos e alguns leucócitos no lúmen. Não confundir os sinusoides com espaços artificiais causados pela fratura do corte. No compartimento hematopoiético há células das linhagens eritroide e mieloide, nem sempre fáceis de distinguir nesta coloração, megacariócitos (células grandes), macrófagos e células maduras.

6.3. Esfregaço de medula óssea por punção esternal, Wright

Entre células maduras, sobretudo eritrócitos, identificar as células hematopoiéticas descritas nas secções 5.4, 5.5 e 5.7:

• linhagem trombopoiética: megacariócito, de grande tamanho, núcleo lobado e citoplasma irregular;
• linhagem eritroide: pró-eritroblasto, eritroblasto basófilo, policromático e ortocromático;
• linhagem mieloide: mieloblasto, promielócito, mielócitos neutrófilo, eosinófilo e basófilo, metamielócitos e neutrófilos em banda.