Técnicas histológicas

1. Conceitos básicos

A Histologia é a ciência que estuda os tecidos biológicos. Um tecido é um conjunto de células, de um ou mais tipos, e de material extracelular, organizados de modo a desempenhar uma ou mais funções específicas nos organismos multicelulares. Um órgão é uma unidade anatómica e funcional constituída, habitualmente, pela associação organizada de dois ou mais tipos de tecidos que cooperam em funções específicas.

Há quatro tipos básicos de tecidos:

Cada órgão combina vários destes tecidos. O estômago, por exemplo, tem epitélio de revestimento e glandular, tecido conjuntivo, músculo liso e tecido nervoso.

2. Níveis de visualização dos tecidos

O que se consegue ver depende do poder de resolução do instrumento, isto é, da menor distância a que dois pontos ainda se distinguem como separados.

O limite do microscópio ótico convencional relaciona-se com o comprimento de onda da luz visível e a abertura numérica do sistema. A microscopia eletrónica usa eletrões acelerados, de comprimento de onda muito menor, permitindo resolver detalhes ultraestruturais. A resolução efetiva depende também do instrumento e da preparação da amostra; não corresponde necessariamente ao limite físico máximo.

3. Microscópio ótico

3.1. Componentes

O microscópio ótico composto tem uma parte ótica e uma parte mecânica:

• Fonte de luz e condensador, por baixo da platina: iluminam a preparação e concentram o feixe. O diafragma de abertura do condensador regula a abertura do cone de iluminação, influenciando contraste, resolução e profundidade de campo; a intensidade é ajustada principalmente no sistema de iluminação.
• Platina: suporte onde se coloca a lâmina, com pinças e comandos de deslocação nos dois eixos.
• Objetivas, montadas num revólver: produzem a imagem ampliada. Ampliações habituais de 4×, 10×, 40× e 100× (esta última de imersão, usada com óleo).
• Oculares: ampliam de novo a imagem da objetiva, em regra 10×. A ampliação total é o produto das duas (objetiva 40× com ocular 10× dá 400×).
• Parafusos macrométrico e micrométrico: aproximam ou afastam a platina da objetiva para focar; o macrométrico faz o ajuste grosseiro e o micrométrico o fino.

3.2. Manejo

1. Ajustar as oculares: distância interpupilar (até se ver um só campo circular) e correção dióptrica de cada olho. A observação é binocular, com os dois olhos abertos.
2. Colocar a lâmina na platina, com a lamela voltada para cima, presa pelas pinças.
3. Focar começando sempre pela objetiva de menor ampliação: a de 4× tem maior campo e maior distância de trabalho, o que permite localizar a zona de interesse sem risco de partir a lâmina. Depois passa-se progressivamente às objetivas de maior ampliação, corrigindo só com o micrométrico.
4. No fim: voltar à objetiva de menor ampliação e retirar a lâmina sem baixar a platina de forma brusca; limpar o óleo da objetiva de imersão.

4. Preparação dos tecidos para microscopia ótica

4.1. Problemas e soluções

Muitos tecidos são demasiado espessos, pouco contrastados e suscetíveis de degradação para observação direta por microscopia ótica convencional. A histologia de rotina recorre, por isso, à preparação descrita a seguir. Contudo, células e tecidos frescos ou vivos podem ser observados por técnicas apropriadas, como contraste de fase e de interferência. Cada etapa da técnica de rotina resolve um problema concreto:

4.2. Fixação

Após a colheita e interrupção das condições de manutenção do tecido, desenvolvem-se alterações que incluem autólise, por ação das enzimas celulares. A putrefação resulta da degradação por microrganismos e depende das condições de conservação. A fixação procura limitar estes processos e estabilizar a arquitetura, sobretudo por ligação ou precipitação de proteínas. A preparação pode introduzir artefactos, como retração, fendas e alterações de volume, que não devem ser interpretados como estruturas do tecido vivo.

• Formaldeído: o fixador de rotina é habitualmente o formol neutro tamponado a 10 %, correspondente a aproximadamente 4 % de formaldeído. Atua pela formação de ligações cruzadas entre proteínas.
• Glutaraldeído e, depois, tetróxido de ósmio: usados em microscopia eletrónica; o ósmio fixa também os lípidos e dá contraste às membranas.

A peça deve ser pequena e mergulhada rapidamente num volume de fixador muito superior ao seu, porque o fixador penetra devagar. Nos órgãos grandes, em animais, pode fixar-se por perfusão através dos vasos.

4.3. Inclusão

Para cortar um tecido em fatias finas é preciso dar-lhe uma consistência firme e homogénea. Na inclusão, o tecido é impregnado por um meio que solidifica, habitualmente parafina. Como a parafina não se mistura com a água, a inclusão exige passos prévios:

1. Desidratação: banhos de álcool de concentração crescente (70 % a 100 %) retiram a água do tecido.
2. Diafanização (clarificação): o álcool é substituído por um solvente miscível com a parafina (xilol, toluol), que torna o tecido translúcido.
3. Impregnação em parafina fundida, na estufa a cerca de 58 a 60 °C, e formação de um bloco que endurece ao arrefecer.

Na microscopia eletrónica de transmissão, utilizam-se frequentemente resinas epóxi, que permitem cortes ultrafinos. Na microscopia eletrónica de varrimento, a preparação destina-se sobretudo à observação da superfície e não exige esses cortes convencionais.

Na preparação convencional em parafina, os solventes extraem grande parte dos lípidos, especialmente os lípidos neutros das gotículas. Os adipócitos uniloculares apresentam, por isso, grandes áreas opticamente vazias. A demonstração de lípidos pode recorrer a cortes de congelação e colorações apropriadas.

4.4. Corte (microtomia)

O bloco de parafina é cortado no micrótomo em fatias de 3 a 10 µm, estendidas em água morna e transferidas para lâminas de vidro. Na microscopia eletrónica de transmissão, o ultramicrótomo produz cortes ultrafinos, habitualmente da ordem de 40 a 90 nm, recolhidos em grelhas apropriadas, geralmente metálicas, para contrastação e observação.

Para diagnóstico intraoperatório rápido pode utilizar-se congelação e corte no criostato, dispensando a inclusão prévia em parafina. Pode preservar lípidos e determinadas atividades enzimáticas, conforme o processamento subsequente; pode também produzir artefactos de congelação e ter menor qualidade morfológica do que a técnica convencional.

Um corte é uma imagem bidimensional de uma estrutura tridimensional. A mesma estrutura tem aspetos muito diferentes conforme o plano de corte: um tubo cortado transversalmente aparece como um anel, e longitudinalmente como duas faixas paralelas. Uma célula cortada fora do plano do núcleo parece não ter núcleo.

4.5. Coloração

Antes de corar, a parafina é removida com xilol e o corte é reidratado (álcoois de concentração decrescente), porque a maioria dos corantes é aquosa. Depois da coloração, o corte volta a ser desidratado e coberto com uma lamela colada com um meio de montagem.

5. Princípios químicos da coloração

5.1. Corantes ácidos e básicos

A maior parte dos corantes histológicos comporta-se como ácido ou base e liga-se aos componentes do tecido por interações eletrostáticas.

• Os corantes básicos têm a porção corada com carga positiva (catiónicos). Reagem com os componentes aniónicos do tecido, ou seja, os que têm grupos com carga negativa. Esses componentes dizem-se basófilos («amantes de bases»).
• Os corantes ácidos têm a porção corada com carga negativa (aniónicos). Reagem com os componentes catiónicos, com grupos de carga positiva. Esses componentes dizem-se acidófilos (ou eosinófilos, quando o corante é a eosina).

5.2. Hematoxilina e eosina (H&E)

A H&E é a coloração de rotina em Histologia e em anatomia patológica.

• A hematoxilina não é, em rigor, um corante básico, mas comporta-se como tal quando combinada com um mordente metálico. Cora a azul-violeta os componentes ácidos: núcleos (cromatina), ribossomas e matriz cartilagínea.
• A eosina é um corante ácido. Cora a rosa os componentes básicos: citoplasma da maioria das células, fibras de colagénio, citoplasma das células musculares e eritrócitos.

Ao ler uma preparação de H&E: azul ou roxo significa ácidos nucleicos ou glicosaminoglicanos sulfatados; rosa significa proteínas. Um citoplasma azulado indica muito RNA, típico de células que sintetizam proteínas em quantidade (plasmócitos, células acinosas do pâncreas). Os espaços opticamente vazios podem resultar da extração de componentes, como lípidos ou glicogénio, mas também corresponder a lúmenes reais, espaços extracelulares ou artefactos de retração. A interpretação depende da arquitetura tecidular e, quando necessário, de colorações específicas.

5.3. Outras colorações

A metacromasia é a aquisição de uma cor diferente da habitual do corante por componentes com elevada densidade de grupos aniónicos próximos. Essa densidade favorece interações entre moléculas de certos corantes básicos, alterando as suas propriedades óticas. Grânulos dos mastócitos e matriz cartilagínea podem, por exemplo, adquirir tonalidades púrpuras ou avermelhadas com azul de toluidina, em vez de azul.

6. Esfregaço de sangue

6.1. Objetivos

O sangue não precisa de ser cortado: espalha-se numa camada de uma só célula de espessura. O esfregaço é corado com corantes do tipo Romanowsky (Wright, Giemsa ou combinação), que distinguem os vários tipos de células. Serve para:

• verificar anomalias morfológicas dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas;
• fazer a contagem diferencial dos leucócitos;
• detetar parasitas no sangue, como os da malária e da filaríase.

Os analisadores hematológicos automáticos permitem a contagem e caracterização quantitativa das células. Perante resultados suspeitos ou discordantes e quando é necessária avaliação morfológica detalhada, a observação do esfregaço continua a ser indispensável.

6.2. Técnica

1. Colocar uma gota de sangue com cerca de 4 mm de diâmetro a cerca de 5 mm da zona fosca da lâmina.
2. Encostar uma segunda lâmina à frente da gota, num ângulo de 30 a 40 graus, e recuar até tocar a gota; esperar que o sangue se espalhe lateralmente ao longo da aresta.
3. Com um movimento suave e contínuo, arrastar a lâmina para a frente, mantendo o ângulo e a velocidade constantes.
4. Um esfregaço bem feito ocupa cerca de três quartos do comprimento da lâmina e termina numa borda emplumada, onde as células estão numa só camada. Deixar secar ao ar.

O ângulo e a velocidade determinam a espessura: ângulo maior ou movimento mais rápido dão um esfregaço espesso; ângulo menor ou movimento lento dão um esfregaço fino.

6.3. Coloração

1. Cobrir o esfregaço com 4 a 10 gotas de corante, com agitação manual durante 2 minutos. O corante contém metanol, que fixa as células.
2. Juntar o mesmo número de gotas de água destilada e agitar mais 2 minutos, sem deixar escorrer a solução.
3. Lavar sem arrastar o esfregaço, deixar secar e montar a lamela.

6.4. Observação

Observa-se preferencialmente na região de monocamada, próxima mas não na extremidade da borda emplumada. Os eritrócitos devem estar maioritariamente separados ou com contacto limitado. Nas zonas espessas sobrepõem-se; nas excessivamente finas podem sofrer distorção e apresentar distribuição celular pouco representativa.

Um eritrócito normal tem dimensões próximas das do núcleo de um linfócito pequeno e palidez central de cerca de um terço do diâmetro. A microcitose é a diminuição do tamanho eritrocitário; a hipocromia, a menor coloração hemoglobínica, geralmente com maior palidez central. Podem coexistir, como frequentemente na anemia ferropénica, mas são alterações distintas. A poiquilocitose corresponde a formas eritrocitárias anormais.

O esfregaço pode também demonstrar parasitas sanguíneos:

• Plasmodium: parasita unicelular que causa a malária; vê-se dentro dos eritrócitos.
• Os tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, agente da doença de Chagas, circulam extracelularmente e podem ser observados entre os eritrócitos, sobretudo na fase aguda, de maior parasitemia. Na fase crónica, a baixa parasitemia limita a sensibilidade do esfregaço. A transmissão vetorial ocorre pela entrada de parasitas das fezes de triatomíneos através da pele lesada ou de mucosas; não se confunde com inoculação pela saliva do inseto.