Lisossomas e fagocitose

1. Da endocitose à degradação lisossomal

O sistema endossoma–lisossoma recebe material proveniente da membrana plasmática, do meio extracelular, do aparelho de Golgi e do próprio citoplasma. Não corresponde a uma cadeia de sacos estáticos: é uma rede dinâmica de compartimentos que alteram progressivamente a composição da membrana, as proteínas Rab, os fosfoinosítidos, a morfologia e o pH.

As principais entradas são:

• endocitose mediada por recetor, que concentra ligandos específicos em vesículas revestidas;
• endocitose em fase fluida e macropinocitose, que internalizam líquido e solutos;
• fagocitose, especializada na ingestão de partículas grandes;
• tráfego proveniente da rede trans-Golgi, que entrega hidrolases e proteínas de membrana;
• autofagia, que encaminha constituintes citoplasmáticos para degradação.

1.1 Endossoma precoce: uma estação de triagem

O endossoma precoce situa-se frequentemente na periferia celular e apresenta domínios tubulares e vacuolares. Os túbulos, com elevada razão área/volume, favorecem a recuperação de proteínas de membrana; a região vacuolar concentra a carga solúvel que seguirá para degradação.

A sua identidade molecular inclui:

• Rab5, pequena GTPase que recruta efetores de ancoragem e fusão;
• PI3P, produzido pela PI3-cinase de classe III VPS34 e reconhecido por proteínas com domínios FYVE ou PX;
• EEA1 e outras proteínas efetoras de Rab5/PI3P;
• v-ATPase, que bombeia protões para o lúmen.

O pH desce para cerca de 6,0–6,5. Esta acidificação é suficiente para dissociar muitos complexos ligando–recetor, mas ainda não cria a capacidade hidrolítica máxima do lisossoma. A dissociação permite destinos diferentes: o recetor pode reciclar, enquanto o ligando permanece no compartimento vacuolar.

Existem duas vias principais de reciclagem:

1. a reciclagem rápida, muitas vezes dependente de Rab4, que devolve diretamente a carga à membrana;
2. a reciclagem lenta, através do endossoma de reciclagem perinuclear, associada a Rab11.

Em células polarizadas pode ainda ocorrer transcitose: uma molécula é endocitada num domínio da membrana, atravessa a célula no sistema endossómico e é libertada noutro domínio.

1.2 Maturação para endossoma tardio

O endossoma precoce amadurece por remodelação contínua. Não é necessário imaginar que toda a carga sai numa vesícula nova; o próprio compartimento altera a sua identidade.

Durante a maturação ocorre:

1. remoção de componentes destinados a reciclagem;
2. conversão de Rab5 em Rab7;
3. alteração do repertório de fosfoinosítidos e efetores;
4. deslocação sobre microtúbulos em direção à região perinuclear;
5. aumento da acidificação;
6. formação de vesículas intraluminais;
7. aquisição de competência para fusão com lisossomas.

Os endossomas tardios são geralmente mais ácidos, com pH inferior a cerca de 6, enriquecidos em Rab7, proteínas LAMP e no lípido LBPA/BMP. A sua morfologia multivesicular resulta da invaginação da membrana limitante para o lúmen.

1.3 Corpos multivesiculares e complexos ESCRT

Uma proteína transmembranar destinada a degradação tem de ser retirada da membrana limitante do endossoma. Caso contrário, após fusão com o lisossoma, o seu domínio citosólico permaneceria protegido do lúmen. A solução é incorporá-la em vesículas intraluminais (intraluminal vesicles, ILV), formando um corpo multivesicular (multivesicular body, MVB).

O processo é coordenado pelos complexos ESCRT:

1. a ubiquitinação da carga funciona como sinal de seleção;
2. ESCRT-0 concentra a carga ubiquitinada em domínios endossómicos;
3. ESCRT-I e ESCRT-II deformam a membrana para o lúmen;
4. ESCRT-III executa a constrição e cisão do colo da vesícula;
5. a ATPase VPS4 desmonta e recicla a maquinaria;
6. desubiquitinases recuperam ubiquitina antes ou durante a incorporação da carga.

A topologia desta cisão é invulgar: a vesícula brota para longe do citosol, tal como na abscisão final da citocinese e na gemulação de certos vírus envelopados.

Quando o MVB se funde com um lisossoma, as ILV e as proteínas nelas contidas são degradadas. Quando se funde com a membrana plasmática, as ILV são libertadas como exossomas. Estes transportam proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, mas a sua composição depende da célula e do estado fisiopatológico; não são simplesmente “resíduos celulares”.

Alguns vírus exploram ESCRT para sair da célula. No VIH, proteínas virais recrutam componentes ESCRT para promover a cisão do virião em gemulação. A semelhança é topológica, não significa que o vírus utilize toda a via endossómica.

2. Dois ciclos endocíticos paradigmáticos

2.1 LDL e recetor de LDL

As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) transportam colesterol esterificado no plasma. A apolipoproteína B-100 é reconhecida pelo recetor de LDL (LDLR) na superfície celular.

O ciclo decorre assim:

1. LDL liga-se ao LDLR;
2. o recetor concentra-se em depressões revestidas por clatrina através de adaptadores;
3. a vesícula perde o revestimento e funde-se com o endossoma precoce;
4. a acidificação enfraquece a interação LDL–LDLR;
5. o LDLR entra em túbulos de reciclagem e regressa à membrana;
6. a LDL permanece no compartimento em maturação e chega ao lisossoma;
7. a apolipoproteína é degradada em aminoácidos e os ésteres de colesterol são hidrolisados;
8. o colesterol livre é transferido para outras membranas e para o retículo endoplasmático.

O aumento de colesterol intracelular reduz a síntese de novo colesterol, favorece a sua esterificação e diminui a expressão de LDLR. Na hipercolesterolemia familiar, variantes patogénicas em LDLR podem impedir a síntese, o transporte para a superfície, a ligação a LDL, a internalização ou a reciclagem. Variantes em APOB e ganho de função em PCSK9 também podem elevar LDL-colesterol. O fenótipo resulta da menor depuração plasmática de LDL e do aumento do risco aterosclerótico.

2.2 Transferrina: reciclagem sem degradação

A transferrina diférrica liga-se ao recetor de transferrina à superfície. No endossoma ácido, o ferro é libertado, reduzido e transportado para o citosol; porém, a apotransferrina permanece associada ao recetor. O complexo recicla até à membrana, onde o pH neutro promove a libertação da apotransferrina.

O contraste é útil: LDL é carga degradativa; transferrina é carga predominantemente reciclada. Em ambos os casos, a acidificação endossómica dá direcionalidade ao ciclo.

3. Macropinocitose e fagocitose

3.1 Macropinocitose

Na macropinocitose, sinais de fatores de crescimento ou recetores imunitários promovem reorganização de actina e formação de pregas membranares. O encerramento das pregas aprisiona grandes volumes de fluido extracelular em macropinossomas. Não depende de um revestimento proteico único nem seleciona inicialmente uma carga específica.

É importante em células apresentadoras de antigénio, que amostram o meio, e pode ser explorada por células tumorais para obter aminoácidos a partir de proteínas extracelulares. O macropinossoma pode reciclar membrana, amadurecer e fundir-se com lisossomas.

3.2 Fagocitose: reconhecimento e ingestão

A fagocitose internaliza partículas tipicamente superiores a 0,5 μm, como bactérias, fungos, células apoptóticas e detritos. É particularmente eficiente em macrófagos, neutrófilos e células dendríticas.

O processo tem fases distintas:

1. quimiotaxia e contacto — a célula aproxima-se e reconhece a partícula;
2. reconhecimento direto — recetores de reconhecimento de padrões detetam estruturas microbianas;
3. opsonização — IgG, C3b e outras opsoninas revestem a partícula;
4. ativação de recetores — recetores Fcγ ou do complemento iniciam sinalização;
5. polimerização de actina — pseudópodes envolvem a partícula;
6. fecho do copo fagocítico — forma-se o fagossoma;
7. maturação — o fagossoma troca Rab5 por Rab7, acidifica e interage com endossomas;
8. fusão com lisossomas — forma-se um fagolisossoma degradativo.

A opsonização aumenta simultaneamente a eficiência e a especificidade da captura. Na fagocitose mediada por FcγR, a sinalização ativa pequenas GTPases da família Rho, nucleadores de actina e miosinas. A membrana necessária provém da superfície e também de reservatórios intracelulares mobilizados para o copo fagocítico.

3.3 Maturação e destruição da carga

O fagossoma recém-formado não é imediatamente microbicida. A maturação implica acidificação por v-ATPase, aquisição de proteínas LAMP, entrega de hidrolases e fusão com lisossomas. Nos neutrófilos e macrófagos ativados, a NADPH oxidase gera superóxido no lúmen; dele derivam espécies reativas de oxigénio. Nos neutrófilos, a mieloperoxidase utiliza peróxido de hidrogénio e cloreto para produzir ácido hipocloroso.

Outros mecanismos incluem proteases, lipases, lisozima, péptidos antimicrobianos, privação de nutrientes e espécies reativas de azoto. A eficácia resulta da cooperação entre pH, enzimas e química oxidativa.

Alguns microrganismos sobrevivem ao interferir com esta via. Mycobacterium tuberculosis restringe a maturação do fagossoma; Listeria monocytogenes rompe a membrana e escapa para o citosol; Coxiella burnetii tolera um vacúolo ácido. Estes exemplos mostram que “ser fagocitado” não equivale automaticamente a “ser destruído”.

4. Lisossoma: conceito, estrutura e composição

4.1 Descoberta e significado funcional

Christian de Duve identificou os lisossomas ao estudar a distribuição subcelular de enzimas hidrolíticas. A fosfatase ácida apresentava latência: a atividade aumentava quando as membranas eram rompidas. Esta observação indicava que a enzima estava sequestrada num compartimento membranar.

A terminologia clássica distingue lisossomas primários, lisossomas secundários e corpos residuais. É útil descritivamente, mas o modelo atual vê uma rede endolisossomal contínua e dinâmica, com ciclos de fusão, fissão, reconstituição e variação funcional.

4.2 Hidrolases ácidas e compartimentalização

O lúmen lisossomal contém dezenas de hidrolases:

• proteases, sobretudo catepsinas;
• nucleases;
• lipases e fosfolipases;
• glicosidases;
• fosfatases;
• sulfatases.

Estas enzimas têm atividade ótima em pH ácido. A v-ATPase utiliza ATP para transportar H⁺ para o lúmen, mantendo um pH aproximado de 4,5–5,0, enquanto o citosol permanece próximo de 7,2. Canais e transportadores de contra-iões dissipam o potencial elétrico que, de outro modo, limitaria o bombeamento de protões.

A compartimentalização oferece duas salvaguardas. Primeiro, concentra enzimas e substratos num microambiente adequado. Segundo, limita a ação das hidrolases sobre o citosol; se pequenas quantidades escaparem, o pH citosólico reduz a sua atividade. Isto não torna a rutura lisossomal inofensiva: permeabilização extensa pode libertar catepsinas e contribuir para morte celular.

4.3 Membrana lisossomal

A membrana não é uma barreira passiva. Contém aproximadamente duas dezenas de famílias de proteínas com funções de:

• transporte de aminoácidos, monossacáridos, nucleótidos, colesterol e iões;
• acidificação e homeostase eletroquímica;
• reconhecimento, ancoragem e fusão;
• sinalização nutricional, incluindo recrutamento de mTORC1;
• reparação e exocitose lisossomal.

LAMP1 e LAMP2 são glicoproteínas muito abundantes e fortemente N-glicosiladas. Os seus domínios luminais formam um glicocálice que ajuda a proteger a membrana da digestão. A isoforma LAMP2A funciona como recetor da autofagia mediada por chaperonas: reconhece substratos apresentados por Hsc70, oligomeriza e participa na sua translocação.

LIMP-2/SCARB2 é relevante por transportar β-glucocerebrosidase para o lisossoma numa via independente de manose-6-fosfato. Isto recorda que M6P é a via dominante para muitas hidrolases, não a única solução biológica.

5. Direcionamento das hidrolases por manose-6-fosfato

As hidrolases lisossomais solúveis são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso e entram na via secretora. Para não serem secretadas constitutivamente, recebem no Golgi o marcador manose-6-fosfato (M6P).

O mecanismo completo é o seguinte:

1. a hidrolase é translocada para o RE e recebe um oligossacárido N-ligado;
2. no cis-Golgi, a UDP-GlcNAc:enzima lisossomal GlcNAc-1-fosfotransferase reconhece uma superfície conformacional da hidrolase, o signal patch;
3. a fosfotransferase transfere GlcNAc-1-fosfato para resíduos de manose;
4. a enzima de desocultação remove o GlcNAc terminal e expõe M6P;
5. na rede trans-Golgi, recetores de M6P ligam a hidrolase;
6. adaptadores GGA/AP-1 e clatrina formam transportadores para o endossoma;
7. o pH endossómico promove a dissociação da hidrolase;
8. o recetor regressa ao Golgi, sobretudo através do complexo retromer e vias associadas;
9. a hidrolase perde o fosfato e sofre maturação proteolítica, reduzindo a probabilidade de voltar a ligar o recetor.

Existem recetores de M6P dependente e independente de catião. Uma fração de hidrolases pode escapar e ser secretada; pode depois ser recaptada por recetores de M6P à superfície, princípio explorado na terapêutica de substituição enzimática.

Na mucolipidose II, variantes bialélicas graves em GNPTAB comprometem a fosfotransferase. Muitas hidrolases não recebem M6P, são secretadas e faltam no lisossoma. Consequentemente, acumulam-se múltiplos substratos em inclusões celulares. Na mucolipidose III, a atividade residual costuma produzir uma apresentação mais tardia e menos grave.

6. Doenças de armazenamento lisossomal

Uma doença de armazenamento lisossomal não é apenas uma “sacola cheia”. A acumulação primária altera tráfego, sinalização, homeostase do cálcio, metabolismo lipídico, autofagia e função mitocondrial. Tecidos pós-mitóticos, como neurónios e músculo, são particularmente vulneráveis à acumulação crónica.

6.1 Correções terminológicas importantes

A classificação histórica reúne entidades diferentes e contém simplificações que não devem ser memorizadas como equivalências:

• Niemann–Pick A/B resulta de deficiência de esfingomielinase ácida; Niemann–Pick C resulta de defeito em NPC1/NPC2, não da mesma enzima;
• doença de Pompe resulta de deficiência de α-glucosidase ácida;
• doença de Danon resulta de deficiência de LAMP2, não de fucosidase;

6.2 Niemann–Pick como exemplo de relação estrutura–função

Na deficiência de esfingomielinase ácida, macrófagos carregados de lípidos adquirem aspeto espumoso e acumulam-se no fígado e baço. No fígado, as células de Kupffer podem ficar distendidas; no baço, os macrófagos acumulam inclusões lipídicas. Na forma A existe neurodegenerescência grave, com lesão de células de Purkinje do cerebelo que contribui para ataxia e alterações posturais. Em Niemann–Pick C, o colesterol não esterificado e outros lípidos ficam retidos no sistema endolisossomal, perturbando o tráfego de colesterol para o RE e outros compartimentos.

7. Integração com a prática: β-glicuronidase e latência

A β-glicuronidase é uma hidrolase ácida enriquecida em lisossomas. Num homogeneizado, a sua distribuição permite acompanhar a fração lisossomal. A interpretação exige dois conceitos:

• atividade específica: atividade enzimática por quantidade de proteína, útil para avaliar enriquecimento;
• latência: parte da atividade só se torna acessível quando a membrana lisossomal é permeabilizada ou rompida.

Uma fração pode conter muita atividade total por ter muita proteína, mas apresentar pouco enriquecimento. Inversamente, uma fração pequena pode ter elevada atividade específica. A latência demonstra integridade membranar: substrato e enzima estão separados enquanto o lisossoma permanece intacto.

No ensaio com glicuronídeo de fenolftaleína, a hidrólise decorre em meio ácido, compatível com a enzima. A alcalinização interrompe a reação e converte a fenolftaleína na forma colorida quantificável. O pH de revelação não representa o ótimo catalítico da β-glicuronidase.

8. Integração clínica e farmacológica

Vários princípios da biologia lisossomal têm aplicação clínica e farmacológica direta:

• substituição enzimática: uma enzima recombinante com glicanos apropriados pode ser captada e entregue ao lisossoma;
• redução de substrato: diminui a síntese do metabolito que se acumula;
• chaperonas farmacológicas: estabilizam certas variantes enzimáticas e favorecem a chegada ao lisossoma;
• terapia génica e edição genética: procuram restaurar uma fonte duradoura de enzima;
• modulação de exocitose lisossomal: pode auxiliar remoção de material, mas também redistribuir carga patológica;
• inibição da acidificação: bafilomicina A1 inibe v-ATPase; cloroquina e hidroxicloroquina acumulam-se em compartimentos ácidos e perturbam a função endolisossomal. Estes agentes são ferramentas experimentais e têm efeitos sistémicos, não “desligam” seletivamente um único passo.

9. Resumo de alto rendimento

• O endossoma precoce, definido por Rab5 e PI3P, separa reciclagem de degradação.
• A acidificação dissocia ligandos e recetores e aumenta progressivamente até ao lisossoma.
• A conversão Rab5→Rab7 acompanha a maturação para endossoma tardio.
• ESCRT incorpora carga ubiquitinada em vesículas intraluminais de MVB.
• MVB fundido com lisossoma promove degradação; fundido com membrana liberta exossomas.
• LDLR recicla, enquanto LDL segue para degradação e liberta colesterol.
• Transferrina e o seu recetor reciclam depois da libertação endossómica de ferro.
• Macropinocitose capta fluido; fagocitose capta partículas grandes por um processo dependente de actina.
• O fagossoma amadurece e funde-se com lisossomas; fagocitose não garante destruição se o microrganismo bloquear a via.
• O lisossoma mantém pH 4,5–5,0 por v-ATPase e contém hidrolases ácidas.
• LAMP1/2 protegem e organizam a membrana; LAMP2A participa na autofagia mediada por chaperonas.
• A maioria das hidrolases recebe M6P no Golgi e é entregue por recetores de M6P.
• Doenças lisossomais podem resultar de defeito enzimático, de transporte, de marcação ou de proteínas de membrana.
• A β-glicuronidase é marcador lisossomal; a sua latência evidencia a integridade da membrana.