Controlo de qualidade proteica e degradação intracelular

1. Proteostase: produzir, dobrar, vigiar e eliminar

A proteostase é o equilíbrio dinâmico entre síntese, dobramento, montagem, transporte, reparação e degradação de proteínas. A sequência de aminoácidos contém a informação necessária para a conformação nativa, mas o interior celular é concentrado, heterogéneo e sujeito a stress. Por isso, a célula precisa de uma rede de chaperonas e sistemas de controlo de qualidade.

Uma proteína pode falhar por:

• variante genética que destabiliza a estrutura;
• erro de tradução ou modificação pós-traducional incompleta;
• oxidação, glicação, alteração de pH ou temperatura;
• deficiência de cofator ou de parceiro de montagem;
• sobrecarga da capacidade de dobramento;
• bloqueio de transporte ou de degradação.

O destino não é decidido por uma inspeção única. A proteína pode tentar dobrar-se várias vezes, ser retida, regressar a uma etapa anterior, ser direcionada para degradação associada ao RE (ERAD) ou formar agregados removidos por autofagia.

2. Modificações que condicionam estrutura e destino

2.1 Glicosilação N-ligada

No retículo endoplasmático (RE), o oligossacárido precursor é transferido para uma asparagina de uma sequência Asn–X–Ser/Thr, desde que X não seja prolina. As glicoses terminais são depois removidas de modo ordenado. Este processamento não é apenas decorativo: cria um temporizador de controlo de qualidade reconhecido por calnexina e calreticulina.

A ocupação de um local de N-glicosilação pode:

• favorecer o dobramento e a solubilidade;
• proteger contra proteólise;
• permitir reconhecimento por lectinas;
• influenciar tráfego e estabilidade à superfície;
• funcionar como sinal de persistência de uma conformação defeituosa.

2.2 Lipidação

A ligação de lípidos aumenta a afinidade por membranas, mas cada modificação tem uma lógica própria.

• Miristoilação: ligação geralmente cotraducional de miristato à glicina N-terminal; costuma ser estável e pode cooperar com sinais eletrostáticos.
• Palmitoilação: ligação reversível de palmitato a cisteínas; permite ciclos de associação/dissociação de membrana.
• Prenilação: ligação de farnesilo ou geranilgeranilo a uma cisteína próxima da extremidade C-terminal, frequentemente num motivo CaaX; é relevante para proteínas Ras e Rho.
• Âncora GPI: adicionada no lúmen do RE à extremidade C-terminal processada; coloca a proteína no folheto não citosólico, que corresponderá ao exterior celular.

A localização topológica importa: uma proteína com GPI nunca atravessa o citosol durante o tráfego vesicular, porque permanece no folheto luminal/extracelular.

2.3 Pontes dissulfureto e PDI

O RE possui um ambiente favorável à formação de pontes dissulfureto. A protein disulfide isomerase (PDI) oxida pares de cisteínas, reduz ligações incorretas e promove a sua isomerização.

No ciclo simplificado:

1. a PDI oxidada recebe eletrões de duas cisteínas do substrato;
2. forma-se uma ponte dissulfureto na proteína;
3. a PDI reduzida é reoxidada, entre outros mecanismos, por Ero1;
4. se a ligação estiver errada, a PDI pode reduzi-la ou reorganizá-la.

A formação de dissulfuretos gera peróxido de hidrogénio e liga o dobramento ao estado redox do RE. Oxidação excessiva não é sinónimo de melhor dobramento.

2.4 Isomerização cis–trans da prolina

A ligação peptídica anterior a uma prolina pode existir nas configurações cis e trans. A interconversão espontânea é lenta e pode limitar o dobramento. As peptidil-prolil cis–trans isomerases — ciclofilinas, FKBPs e parvulinas — aceleram esta etapa. Algumas também integram sinalização; por exemplo, a ciclofilina A liga ciclosporina, e o complexo inibe calcineurina.

2.5 Hemaglutinina como modelo de montagem

A hemaglutinina do vírus influenza ilustra a coordenação entre tradução no RE, N-glicosilação, interação com calnexina, formação de pontes dissulfureto e oligomerização. Só as moléculas corretamente dobradas e montadas em trímeros adquirem competência de exportação.

3. Chaperonas moleculares

3.1 O problema da agregação

O dobramento pode ser representado por um funil energético: muitas conformações iniciais convergem para um conjunto mais restrito de estados de baixa energia. Regiões hidrofóbicas que deveriam ficar enterradas estão temporariamente expostas e podem estabelecer interações intermoleculares, produzindo agregados.

Uma chaperona não contém a “planta” da proteína nem faz parte obrigatória da estrutura final. Liga estados não nativos, impede interações inadequadas e oferece oportunidades adicionais de dobramento.

3.2 Ciclo HSP70

HSP70 possui um domínio de ligação a nucleótido e um domínio de ligação ao substrato. HSP40 entrega o substrato e estimula a hidrólise de ATP, fechando a “tampa” sobre o segmento polipeptídico. Fatores de troca de nucleótido promovem a saída de ADP; a ligação de novo ATP abre a chaperona e liberta o substrato.

O ciclo não garante sucesso. Se a proteína continuar defeituosa, a repetição de tentativas acaba por competir com mecanismos que a encaminham para degradação.

3.3 Chaperoninas HSP60

GroEL forma dois anéis heptaméricos sobrepostos. GroES tapa transitoriamente a cavidade que contém o substrato.

Em termos funcionais:

1. um polipeptídeo não nativo liga-se à entrada hidrofóbica;
2. ATP e GroES fecham a câmara;
3. a alteração conformacional torna a cavidade mais hidrofílica;
4. o substrato tenta dobrar-se sem competir com outras proteínas;
5. a hidrólise de ATP e a ativação do anel oposto levam à libertação.

3.4 Calnexina e calreticulina não são HSP90

O ciclo decorre assim:

1. após transferência do glicano, glicosidases I e II removem duas glicoses;
2. a glicoproteína monoglucosilada liga calnexina ou calreticulina;
3. ERp57 auxilia a formação de dissulfuretos;
4. a remoção da última glicose liberta o substrato;
5. se estiver dobrado, pode sair do RE;
6. se continuar não nativo, UGGT reconhece características expostas e volta a adicionar uma glicose;
7. o substrato regressa ao ciclo;
8. a remoção progressiva de manoses por mannosidases/EDEM favorece a decisão de ERAD.

4. ERAD — degradação associada ao retículo endoplasmático

4.1 Que proteínas entram em ERAD?

ERAD elimina proteínas luminais, transmembranares e citosólicas associadas ao RE que não atingem uma conformação ou montagem aceitável. Os defeitos podem localizar-se no lúmen (ERAD-L), na membrana (ERAD-M) ou no domínio citosólico (ERAD-C), recrutando módulos parcialmente distintos.

Exemplos úteis incluem:

• CFTR ΔF508, que conserva alguma função de canal mas é reconhecida como defeituosa e degradada em grande proporção;
• variantes de PMP22, retidas por calnexina e associadas a neuropatias periféricas;
• proteínas mutadas, oxidadas ou sem parceiro de montagem;
• proteínas reguladoras cuja degradação é fisiológica, como HMG-CoA redutase em determinadas condições.

Na doença de Charcot–Marie–Tooth 1A, a causa mais frequente é duplicação de PMP22; algumas variantes pontuais causam fenótipos por dobramento defeituoso. Não se deve generalizar um mecanismo de uma variante para todas as formas da doença.

4.2 Reconhecimento de glicoproteínas persistentes

A remoção lenta de manoses funciona como temporizador. EDEM acelera remodelação de glicanos e lectinas como OS-9 reconhecem glicanos processados em conjunto com regiões não nativas. O substrato é entregue a complexos de membrana que contêm adaptadores, ligases de ubiquitina e possíveis canais de retrotranslocação.

4.3 Mecanismo passo a passo

1. Reconhecimento: chaperonas, PDI, EDEM e lectinas detetam persistência de uma estrutura não nativa.
2. Entrega: adaptadores como SEL1L aproximam o substrato da ligase E3 HRD1.
3. Retrotranslocação: o polipeptídeo atravessa ou é extraído da membrana por um complexo que pode incluir HRD1, Derlin e outros componentes. Não existe um único canal universal para todos os substratos.
4. Ubiquitinação: uma cascata E1–E2–E3 liga cadeias de ubiquitina a resíduos do substrato expostos no citosol.
5. Extração: a AAA+ ATPase p97/VCP, com cofatores UFD1–NPL4, utiliza ATP para puxar o substrato para o citosol.
6. Deglicosilação: a N-glicanase citosólica remove glicanos N-ligados; desubiquitinases podem remodelar a cadeia.
7. Entrega ao proteassoma: chaperonas e adaptadores mantêm o substrato solúvel e orientam-no para o 26S.
8. Degradação: o proteassoma desenrola e fragmenta o polipeptídeo; a ubiquitina é recuperada.

SEL1L–HRD1 também regula a quantidade de proteínas funcionais e de sensores de stress. Em modelos animais, perturbar SEL1L em células B compromete maturação e homeostase, mostrando que ERAD não é apenas um triturador de “erros raros”.

4.4 HSP90 como alvo farmacológico

Clientes de HSP90 incluem cinases e fatores reguladores oncogénicos. Inibir HSP90 pode destabilizá-los e promover a sua degradação. Geldanamicina é uma ferramenta experimental clássica e originou análogos, mas a toxicidade e propriedades farmacológicas limitaram o seu uso. Não deve ser apresentada simplesmente como fármaco antineoplásico aprovado.

5. Ubiquitinação e proteassoma

5.1 A cascata E1–E2–E3

Ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos ligada covalentemente ao substrato. A cascata ocorre em três níveis:

1. E1 ativa ubiquitina com ATP e forma uma ligação tioéster;
2. E2 recebe a ubiquitina;
3. E3 reconhece o substrato e aproxima E2, conferindo grande parte da especificidade;
4. ciclos repetidos constroem mono- ou poliubiquitinação;
5. desubiquitinases removem ou remodelam a marca.

A ideia “poliubiquitina = degradação” é incompleta. A ligação entre ubiquitinas altera o significado:

• cadeias K48 são o sinal proteassomal canónico;
• K11 participa em controlo do ciclo celular e também em ERAD;
• K63 é frequente em sinalização, reparação de DNA, endocitose e autofagia seletiva;
• K6 associa-se a resposta a dano no DNA e mitofagia;
• cadeias ramificadas e mistas aumentam a complexidade do código.

5.2 Proteassoma 26S

O proteassoma 26S inclui um núcleo catalítico 20S e uma ou duas partículas reguladoras 19S.

O 20S tem quatro anéis empilhados: dois anéis α externos formam a porta e dois anéis β internos contêm sítios catalíticos. As atividades principais são:

• tipo quimotripsina, sobretudo β5;
• tipo tripsina, β2;
• tipo caspase, β1.

A 19S reconhece cadeias de ubiquitina, remove e recicla ubiquitina, abre a porta α e utiliza ATPases AAA+ para desenrolar o substrato. O canal estreito exige que a proteína entre de forma aproximadamente linear. A degradação gera pequenos péptidos posteriormente hidrolisados; alguns podem entrar na apresentação antigénica por MHC I.

O bortezomib inibe o proteassoma e é utilizado, entre outras indicações, no mieloma múltiplo. Células secretoras de imunoglobulinas têm elevada carga proteostática e podem ser especialmente sensíveis. A inibição também aumenta stress do RE e pode induzir respostas compensatórias como autofagia.

6. Autofagia lisossomal

6.1 Três modalidades

Na autofagia mediada por chaperonas (CMA), Hsc70 reconhece um motivo pentapeptídico relacionado com KFERQ. O substrato liga LAMP2A monomérica, desenrola-se e atravessa um complexo de LAMP2A oligomerizado. Chaperonas luminais auxiliam a translocação.

6.2 Macroautofagia basal, induzida e seletiva

A macroautofagia basal remove constituintes envelhecidos e ajuda a manter a homeostase. A privação de nutrientes, diminuição de ATP, ausência de fatores de crescimento, hipoxia, stress oxidativo e acumulação de proteínas aumentam o fluxo autofágico.

Pode ser relativamente não seletiva durante fome ou altamente seletiva:

• mitofagia — mitocôndrias;
• pexofagia — peroxissomas;
• reticulofagia — regiões do RE;
• agrefagia — agregados proteicos;
• xenofagia — microrganismos intracelulares;
• CASA — autofagia assistida por chaperonas em estruturas submetidas a tensão.

6.3 Iniciação: mTORC1, AMPK e ULK1

Em abundância de aminoácidos e fatores de crescimento, mTORC1 associa-se à superfície lisossomal e inibe o complexo ULK1. A via insulina/IGF-1→PI3K→Akt favorece mTORC1 e programas anabólicos. Em baixa energia, AMPK inibe mTORC1 e ativa componentes pró-autofágicos.

Ativado, o complexo ULK1–ATG13–FIP200–ATG101 organiza o local de nucleação. A classe III PI3-cinase VPS34, em complexo com Beclin 1, VPS15 e ATG14L, produz PI3P no fagóforo. Proteínas WIPI e outras efetoras reconhecem PI3P e recrutam a maquinaria de expansão.

Beclin 1 pode ser sequestrada por Bcl-2; fosforilações dependentes de stress, incluindo vias JNK em alguns contextos, reduzem esta inibição. A relação entre autofagia e apoptose é, portanto, regulada e dependente do contexto.

6.4 Expansão do fagóforo: dois sistemas ubiquitin-like

Sistema ATG12:

1. ATG7 atua como enzima E1-like;
2. ATG10 atua como E2-like;
3. ATG12 liga-se covalentemente a ATG5;
4. o conjugado associa-se a ATG16L1 e forma um complexo que marca a membrana em expansão.

Sistema LC3/ATG8:

1. ATG4 cliva pro-LC3 e expõe uma glicina, originando LC3-I;
2. ATG7 ativa LC3-I;
3. ATG3 transfere LC3;
4. o complexo ATG12–ATG5–ATG16L1 favorece a conjugação a fosfatidiletanolamina;
5. forma-se LC3-II, associado às duas faces do fagóforo;
6. LC3 externo pode ser removido por ATG4; LC3 interno é degradado após fusão lisossomal.

Recetores de autofagia seletiva, como p62/SQSTM1, NBR1, OPTN e NDP52, ligam simultaneamente carga ubiquitinada e proteínas ATG8/LC3 através de motivos LIR.

6.5 Fluxo autofágico: como interpretar LC3

Mais LC3-II pode significar maior formação de autofagossomas ou bloqueio da sua degradação. Por isso, uma fotografia isolada não mede fluxo. Compara-se LC3-II e substratos como p62 na presença e ausência de inibidores da acidificação/fusão, por exemplo bafilomicina A1 ou cloroquina. O aumento adicional quando a degradação é bloqueada sugere que existia fluxo ativo.

A simples contagem de pontos LC3 também é ambígua. Deve ser integrada com ensaios de fluxo, morfologia e marcadores da carga.

6.6 Transporte e fusão

Autofagossomas deslocam-se sobre microtúbulos, frequentemente em direção perinuclear por dineína, onde são mais abundantes lisossomas competentes. Rab7, complexos HOPS, SNARE e proteínas de contacto lipídico participam na maturação e fusão. O produto, autofagolisossoma, degrada membrana interna e carga; transportadores devolvem metabolitos ao citosol.

6.7 Mitofagia

Quando uma mitocôndria perde potencial de membrana, PINK1 deixa de ser eficientemente importada e degradada e acumula-se na membrana externa. PINK1 fosforila ubiquitina e a ligase E3 Parkin, desencadeando um circuito de ubiquitinação.

Receptores como OPTN e NDP52 reconhecem ubiquitina e recrutam LC3. Existem vias independentes de Parkin: BNIP3, NIX e FUNDC1 possuem motivos LIR; cardiolipina externalizada também pode sinalizar mitofagia. Alterações em PINK1/Parkin estão associadas a formas hereditárias de parkinsonismo, embora a doença humana não se reduza a um único defeito linear.

7. Proteassoma e autofagia cooperam

O proteassoma é muito eficiente para proteínas solúveis e desenroláveis. Autofagia consegue remover complexos grandes, agregados e organelos inteiros. A sobrecarga de ERAD/proteassoma aumenta a pressão sobre autofagia; bloquear autofagia pode, por sua vez, acumular agregados e sequestrar componentes do sistema ubiquitina–proteassoma.

Esta cooperação explica por que razão uma terapêutica que bloqueia um sistema pode ativar o outro. Também explica a toxicidade: impedir simultaneamente degradação proteassomal e lisossomal pode ultrapassar rapidamente a capacidade adaptativa.

8. Integração clínica

• Fibrose quística: ΔF508-CFTR é degradada por controlo de qualidade apesar de conservar função parcial. Corretores estabilizam dobramento/tráfego; potenciadores aumentam a abertura do canal à superfície.
• Neuropatias por PMP22: dose génica ou variantes estruturais perturbam a proteostase de células de Schwann.
• Mieloma múltiplo: inibidores do proteassoma exploram a elevada carga de síntese de imunoglobulinas.
• Doenças neurodegenerativas: agregação, falha de chaperonas, proteassoma, autofagia e mitofagia interagem; a presença de agregados não prova, por si só, qual foi a falha inicial.
• Cancro: autofagia pode limitar dano e transformação numa fase, mas sustentar tumores estabelecidos sob stress noutra. “Autofagia é boa” ou “autofagia é má” são generalizações inadequadas.

9. Resumo de alto rendimento

• Proteostase integra síntese, dobramento, montagem, transporte e degradação.
• PDI/Ero1 controlam pontes dissulfureto; PPIases aceleram isomerização da prolina.
• HSP70 usa ciclos de ATP e cofatores; HSP60 fornece uma câmara protegida.
• Calnexina e calreticulina são lectinas do RE, não membros da família HSP90.
• UGGT devolve glicoproteínas não nativas ao ciclo calnexina; remoção de manose favorece ERAD.
• ERAD reconhece, retrotransloca, ubiquitina, extrai por p97/VCP e entrega ao proteassoma.
• E3 confere especificidade; a ligação da cadeia de ubiquitina condiciona o destino.
• O proteassoma 26S usa a 19S para reconhecer/desenrolar e o 20S para proteólise.
• Macroautofagia forma um autofagossoma de dupla membrana; CMA usa Hsc70 e LAMP2A.
• mTORC1 inibe e AMPK favorece a iniciação autofágica.
• ATG12–ATG5–ATG16L1 e LC3–PE expandem o fagóforo.
• LC3-II isoladamente não mede fluxo autofágico.
• PINK1/Parkin sinalizam mitocôndrias despolarizadas, mas existem vias alternativas de mitofagia.
• Proteassoma e autofagia são complementares e compensam parcialmente um ao outro.