Tecidos conjuntivos duros II: osso, ossificação e articulações

1. Características gerais

O tecido ósseo é o principal constituinte do esqueleto. É um conjuntivo rígido e inflexível, formado por células e por fibras de colagénio envolvidas numa matriz extracelular mineralizada. Ao contrário da cartilagem, é muito vascularizado e metabolicamente ativo: está em renovação contínua durante toda a vida.

Funções:

• suporte do corpo e proteção de órgãos (encéfalo, coração, pulmões, medula óssea);
• apoio aos músculos esqueléticos e formação de um sistema de alavancas que transforma a contração em movimento, favorecendo a força, a velocidade ou a amplitude conforme a disposição das inserções e dos pontos de apoio;
• reserva mobilizável de cálcio e fosfato (cerca de 99 % do cálcio do organismo), essencial para a calcemia;
• alojamento da medula óssea hematopoiética.

2. Matriz óssea

Considerando a massa seca da matriz óssea, aproximadamente 30–35 % corresponde à fração orgânica e 65–70 % à inorgânica. São estimativas que variam com o tipo e a maturação do osso; no tecido vivo existe também uma componente aquosa significativa.

• Orgânica: sobretudo colagénio tipo I (cerca de 90 %), com substância fundamental (GAG, proteoglicanos) e proteínas não colagénicas (osteocalcina, osteonectina, osteopontina, sialoproteína óssea).
• Inorgânica: cálcio e fosfato na forma de cristais de hidroxiapatite, Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, com bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato.

Os cristais de hidroxiapatite depositam-se ao longo das fibras de colagénio. Esta associação explica as propriedades do osso: o mineral dá dureza e resistência à compressão, o colagénio dá resistência à tração e alguma flexibilidade. Um osso descalcificado em ácido mantém a forma mas fica flexível como borracha; um osso sem colagénio (calcinado) fica quebradiço.

Para estudar o osso ao microscópio há dois métodos: a descalcificação (remoção do mineral com ácido ou EDTA, seguida de corte em parafina), que preserva as células; e o desgaste de osso seco até uma lâmina fina, que preserva a matriz mineral e destrói as células.

3. Células do osso

Os principais tipos celulares descritos a seguir são as células osteoprogenitoras, os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos. Os três primeiros pertencem à linhagem osteoblástica, de origem mesenquimatosa; os osteoclastos têm origem hematopoiética. Nas superfícies quiescentes existem ainda células de revestimento ósseo, derivadas de osteoblastos.

3.1. Células osteoprogenitoras

As células osteoprogenitoras derivam de progenitores mesenquimatosos e estão comprometidas com a linhagem osteoblástica. Conservam capacidade proliferativa e diferenciam-se em osteoblastos. São achatadas, semelhantes a fibroblastos, com núcleo alongado. Persistem após o nascimento, especialmente nas camadas osteogénicas do periósteo e no endósteo, contribuindo para a formação e reparação ósseas.

3.2. Osteoblastos

Os osteoblastos originam-se das células osteoprogenitoras e localizam-se à superfície do osso em formação, onde formam uma monocamada de células cúbicas ou cilíndricas, semelhante a um epitélio simples. São células muito polarizadas, com citoplasma basófilo (RER abundante) e Golgi desenvolvido, que depositam a matriz orgânica para o lado do osso.

Funções:

• sintetizam a matriz orgânica ainda não mineralizada, o osteoide, sobretudo colagénio tipo I e substância fundamental. O osteoide recém-depositado situa-se entre os osteoblastos e a matriz previamente formada. Em cortes descalcificados corados por H&E, a coloração não distingue com segurança osteoide de matriz anteriormente mineralizada; técnicas que preservam o mineral e colorações apropriadas permitem essa distinção;
• sintetizam proteínas não colagénicas (osteocalcina, osteonectina, osteopontina, sialoproteína óssea) e fatores de crescimento (BMP, proteínas morfogenéticas do osso);
• controlam a mineralização: segregam vesículas da matriz ricas em fosfatase alcalina e pirofosfatase, que concentram cálcio e fosfato. Nas vesículas formam-se os primeiros cristais de hidroxiapatite; os cristais rompem a vesícula, crescem e a mineralização propaga-se de forma confluente ao longo das fibras de colagénio;
• participam na regulação dos osteoclastos, em conjunto com osteócitos e células do estroma, através de RANKL, M-CSF e osteoprotegerina (secção 3.4).

A diferenciação dos osteoblastos depende dos fatores de transcrição RUNX2 e Osterix.

Após a fase de formação, alguns osteoblastos ficam incluídos na matriz e tornam-se osteócitos; outros sofrem apoptose ou passam a células de revestimento ósseo (bone-lining cells), achatadas, que permanecem sobre superfícies quiescentes. Por isso, nem toda a superfície óssea apresenta uma fiada de osteoblastos cúbicos ativos.

Displasia cleidocraniana A mutação do gene RUNX2 compromete a diferenciação dos osteoblastos. Resulta em hipoplasia ou ausência das clavículas (os ombros aproximam-se à frente do tórax), fontanelas que não fecham e anomalias dentárias.

3.3. Osteócitos

Quando o osteoblasto fica rodeado pela matriz que segregou, passa a osteócito. É a célula mais abundante do osso maduro.

• Aloja-se numa lacuna (osteoplasto) rodeada de matriz mineralizada.
• Célula achatada, em forma de amêndoa, com núcleo de cromatina condensada e menos organelos do que o osteoblasto.
• Emite prolongamentos citoplasmáticos muito finos que correm em canalículos através da matriz e contactam os prolongamentos dos osteócitos vizinhos e as células de superfície, por junções comunicantes (de hiato).

A mineralização restringe fortemente a difusão direta através da matriz. Os nutrientes provenientes dos vasos chegam aos osteócitos sobretudo por difusão no líquido extracelular das lacunas e dos canalículos. As junções comunicantes entre prolongamentos permitem a troca intercelular de pequenos solutos e sinais. O alcance limitado desta rede, da ordem de 100 µm, condiciona a organização vascular e a espessura do tecido ósseo.

Os osteócitos são metabolicamente ativos: mantêm e renovam a matriz, detetam as cargas mecânicas (mecanorreceção) e sinalizam a formação ou a reabsorção de osso. Podem estar em estado quiescente, formativo ou reabsortivo. Quando morrem, as lacunas ficam vazias e a matriz à volta é reabsorvida.

3.4. Osteoclastos

Os osteoclastos são responsáveis pela reabsorção óssea, indispensável à remodelação e à renovação do osso.

• Células gigantes (até 100 µm) e multinucleadas (até 50 núcleos), com citoplasma acidófilo.
• Situam-se em depressões da superfície óssea escavadas por eles próprios, as lacunas de Howship, mas são células móveis.
• Origem: precursores mononucleados da medula óssea da linhagem monócito-macrófago, que se fundem. Não pertencem à linhagem osteoblástica.

O osteoclasto ativo é polarizado. A face voltada para o osso tem:

• uma bordadura franjada ou pregueada (ruffled border): numerosas pregas irregulares da membrana voltada para o osso, que aumentam a área de transporte, secreção e internalização dos produtos da reabsorção;
• à volta, uma zona selante (zona clara): anel de filamentos de actina onde a membrana adere firmemente ao osso por integrinas, isolando um compartimento subosteoclástico.

O citoplasma tem numerosas mitocôndrias, lisossomas, vesículas e vacúolos, e pouco RER.

Mecanismo da reabsorção. A anidrase carbónica II fornece H^{+} e HCO_{3}^{-} a partir de CO_{2} e água. A H^{+}-ATPase da bordadura franjada transporta protões para o compartimento selado, cujo pH pode aproximar-se de 4,5. O bicarbonato é trocado por cloreto na membrana oposta; o transporte de cloreto para o compartimento subosteoclástico permite manter a acidificação. O meio ácido dissolve a hidroxiapatite. A catepsina K e metaloproteinases, incluindo a MMP-9, degradam a matriz orgânica exposta. Os produtos são endocitados e transportados para a superfície oposta da célula.

Regulação. A osteoclastogénese depende de sinais das células da linhagem osteoblástica, incluindo osteoblastos e osteócitos, e das células do estroma:

• o M-CSF promove a sobrevivência e proliferação dos precursores e favorece a expressão de RANK;
• o RANKL, produzido nomeadamente por osteócitos e células osteoblásticas, liga-se ao recetor RANK dos precursores e promove a diferenciação e fusão;
• a osteoprotegerina (OPG) é um recetor solúvel de captura que se liga ao RANKL, impedindo a sua interação com RANK e reduzindo a osteoclastogénese.

A PTH favorece indiretamente a reabsorção, modificando sinais osteoclastogénicos nas células osteoblásticas e nos osteócitos. A calcitonina pode inibir diretamente a atividade dos osteoclastos através dos seus recetores. Os osteócitos integram ainda estímulos mecânicos, nomeadamente pela regulação da esclerostina, que inibe a formação óssea.

Doenças do equilíbrio formação-reabsorção - Osteoporose: perda de massa óssea com fragilidade e fraturas, por reabsorção superior à formação. O principal fator é a falta de estrogénios após a menopausa, que aumenta a expressão de RANKL. O denosumab, anticorpo anti-RANKL, atua como a osteoprotegerina e reduz a reabsorção. - Osteopetrose: grupo de doenças com deficiência da formação ou da função reabsortiva dos osteoclastos. Entre as causas humanas encontram-se alterações de proteínas necessárias à acidificação, como a ClC-7, codificada por CLCN7, e componentes da bomba de protões. O osso torna-se muito denso, mas pode ser frágil; nas formas graves, a redução dos espaços medulares compromete a hematopoiese. A deficiência de M-CSF do rato experimental op/op demonstra a importância deste fator, sem representar uma causa típica de osteopetrose humana. - Osteomalacia e raquitismo: a osteomalacia corresponde a mineralização inadequada do osteoide, com osso pouco resistente, deformações e fraturas. Pode resultar de défice de vitamina D, alterações do metabolismo do fosfato ou doença renal. Na criança com placas epifisárias abertas, o raquitismo inclui perturbação da mineralização da cartilagem de conjugação, alterando o crescimento esquelético.

4. Organização do tecido ósseo

4.1. Osso compacto e osso esponjoso

Macroscopicamente distinguem-se dois tipos de osso, que têm a mesma composição e diferem na arquitetura:

As trabéculas do osso esponjoso orientam-se segundo as linhas de força, oferecendo a máxima resistência com a mínima massa. Não têm canais de Havers: os osteócitos nutrem-se a partir dos vasos da medula, através dos canalículos.

4.2. Osso compacto: sistemas de Havers

No osso maduro, o colagénio deposita-se em lamelas de 3 a 7 µm. Em cada lamela as fibras são paralelas entre si, mas a orientação muda de uma lamela para a seguinte, como num contraplacado, o que aumenta a resistência. No osso compacto, as lamelas organizam-se de quatro formas:

• Sistemas de Havers (osteónios): cilindros de 4 a 20 lamelas concêntricas à volta de um canal de Havers central, que contém vasos, nervos e conjuntivo laxo, revestido por endósteo. Os osteócitos ficam entre as lamelas, em lacunas, e os canalículos ligam-nos ao canal central. Os osteónios são paralelos ao eixo maior do osso. Cada um é delimitado por uma linha cimentante, rica em matriz e pobre em colagénio.
• Lamelas intersticiais (sistemas intermediários): fragmentos de lamelas entre os osteónios, restos de antigos sistemas de Havers parcialmente reabsorvidos durante a remodelação; já não rodeiam canais.
• Lamelas circunferenciais externas, logo abaixo do periósteo.
• Lamelas circunferenciais internas, junto ao endósteo e à cavidade medular.

Os canais de Volkmann são canais vasculares transversais ou oblíquos, que ligam os canais de Havers entre si, à superfície do osso (periósteo) e à cavidade medular. Ao contrário dos canais de Havers, não são rodeados por lamelas concêntricas.

4.3. Periósteo e endósteo

• Periósteo: reveste a superfície externa dos ossos, exceto nas superfícies articulares. Tem uma camada externa de conjuntivo denso, vascularizada, e uma camada interna com células osteoprogenitoras. Está preso ao osso por feixes de colagénio que penetram na matriz, as fibras de Sharpey. Funções: crescimento em espessura, reparação de fraturas e nutrição do osso, pelos vasos que entram pelos canais de Volkmann.
• Endósteo: revestimento celular fino das superfícies voltadas para a cavidade medular, das trabéculas e das paredes dos canais vasculares internos. Contém células osteoprogenitoras e de revestimento ósseo, com escassa matriz conjuntiva. Participa na formação, remodelação e reparação das superfícies internas; não possui a camada fibrosa externa e as inserções mecânicas características do periósteo.

4.4. Osso primário e osso secundário

O osso primário é geralmente transitório, sendo progressivamente substituído por osso secundário lamelar na remodelação. No adulto saudável predomina amplamente o osso lamelar; podem existir focos de osso entrançado em situações de formação rápida.

4.5. Remodelação e reparação

O tecido ósseo sofre remodelação contínua, por acoplamento entre reabsorção osteoclástica e formação osteoblástica. No osso compacto, osteoclastos escavam túneis (cones de corte), acompanhados por vasos e células osteogénicas; os osteoblastos depositam lamelas concêntricas, formando novos osteónios. No osso esponjoso, a remodelação ocorre sobretudo nas superfícies trabeculares, em cavidades de reabsorção posteriormente preenchidas por matriz nova, sem organização haversiana. Estes processos corrigem microlesões e adaptam a arquitetura às cargas. A taxa de renovação varia com a região, idade e tipo de osso, sendo geralmente mais elevada no trabecular.

Reparação de uma fratura:

1. A rutura vascular origina um hematoma e inflamação. Células próximas da fratura podem morrer. Leucócitos e macrófagos removem detritos celulares; os osteoclastos reabsorvem matriz óssea necrosada.
2. As células osteoprogenitoras do periósteo e do endósteo proliferam, acompanhadas de neoformação vascular. Desenvolve-se um calo mole, com tecido conjuntivo e cartilagem nas regiões apropriadas; junto ao periósteo pode formar-se diretamente osso primário.
3. A cartilagem é progressivamente substituída por osso primário por ossificação endocondral, enquanto prossegue a deposição noutras regiões. Forma-se o calo ósseo, que estabiliza a união entre fragmentos. Estas fases sobrepõem-se parcialmente.
4. O osso primário é remodelado em osso secundário lamelar e o excesso do calo é reabsorvido.

5. Ossificação

O osso forma-se sempre por deposição de matriz por osteoblastos sobre um tecido preexistente. Conforme esse tecido, a ossificação é intramembranosa ou endocondral. Em ambas forma-se primeiro osso primário, depois remodelado.

5.1. Ossificação intramembranosa

A ossificação intramembranosa ocorre no mesênquima, sem molde de cartilagem. Participa na formação dos ossos da abóbada craniana, da maxila e da maior parte da mandíbula, e no crescimento em espessura por deposição subperióstica. O desenvolvimento mandibular inclui também regiões cartilagíneas secundárias.

1. Num mesênquima muito vascularizado, as células mesenquimatosas agregam-se e diferenciam-se diretamente em osteoblastos (centro de ossificação primário).
2. Os osteoblastos segregam osteoide, que mineraliza; os que ficam aprisionados passam a osteócitos.
3. Formam-se trabéculas de osso primário, que crescem e se fundem; o mesênquima entre elas origina a medula óssea.
4. O conjuntivo à superfície condensa-se em periósteo. Mais tarde, as tábuas externa e interna são remodeladas em osso compacto e o centro mantém-se esponjoso (díploe).

5.2. Ossificação endocondral

Um molde de cartilagem hialina é progressivamente substituído por osso. Forma os ossos longos dos membros, as vértebras, a pélvis e os ossos da base do crânio.

1. Forma-se um modelo de cartilagem hialina com a forma do futuro osso, rodeado de pericôndrio.
2. Na região média da diáfise, o pericôndrio torna-se osteogénico e diferencia-se em periósteo; os osteoblastos formam, por ossificação intramembranosa, um colar ósseo periosteal.
3. Em paralelo, os condrócitos centrais maturam e hipertrofiam num programa regulado, com expressão de colagénio X, alterações da matriz e sinais que favorecem a invasão vascular. A matriz cartilagínea calcifica e muitos condrócitos degeneram, deixando septos de cartilagem calcificada.
4. O broto periosteal, com vasos e células osteoprogenitoras e hematopoiéticas, invade a região. Os osteoblastos depositam osteoide sobre os septos remanescentes de cartilagem calcificada, estabelecendo o centro de ossificação primário.
5. A ossificação estende-se para as duas extremidades; os osteoclastos escavam a cavidade medular.
6. Mais tarde (sobretudo depois do nascimento) formam-se centros de ossificação secundários nas epífises.
7. Entre a epífise e a diáfise fica uma placa de cartilagem, a cartilagem de conjugação (disco ou placa epifisária), que permite o crescimento em comprimento. Na epífise mantém-se a cartilagem articular.

5.3. Cartilagem de conjugação

Na placa epifisária, da epífise para a diáfise, sucedem-se zonas que reproduzem no espaço a sequência da ossificação endocondral:

O crescimento em comprimento resulta do equilíbrio entre a proliferação na face epifisária e a substituição por osso na face diafisária: a placa mantém a espessura enquanto se afasta do centro da diáfise. No fim da puberdade, por ação dos estrogénios, a proliferação para, a placa é totalmente substituída por osso (encerramento das epífises) e fica uma linha epifisária. A partir daí o osso já não cresce em comprimento.

Acondroplasia A mutação do recetor 3 do FGF inibe a proliferação dos condrócitos na cartilagem de conjugação. Os ossos longos crescem pouco em comprimento (nanismo com membros curtos), mas os ossos de ossificação intramembranosa, como os do crânio, desenvolvem-se normalmente.

6. Articulações

6.1. Classificação

Classificação funcional

Classificação estrutural

A cartilagem de conjugação é uma união cartilagínea temporária de crescimento. As sinostoses são uniões por tecido ósseo, frequentemente após ossificação de uma união preexistente: não permitem movimento entre os elementos fusionados. As classificações funcional e estrutural não têm correspondência rígida, embora as diartroses correspondam às articulações sinoviais.

6.2. Articulação sinovial

As diartroses são articulações sinoviais. Têm:

• cartilagem hialina articular a revestir as extremidades ósseas, sem pericôndrio;
• cavidade articular com líquido sinovial;
• cápsula articular, com uma camada externa fibrosa de conjuntivo denso, contínua com o periósteo, e uma camada interna, a membrana sinovial.

A membrana sinovial reveste a cavidade, exceto sobre a cartilagem. Tem uma a quatro camadas de células sinoviais de núcleo escuro, sem lâmina basal (não é um epitélio verdadeiro), sobre conjuntivo laxo muito vascularizado. Há dois tipos de células: as células A, semelhantes a macrófagos, que removem detritos da cavidade; e as células B, semelhantes a fibroblastos, que segregam ácido hialurónico e glicoproteína lubrificante (lubricina).

O líquido sinovial é um dialisado do plasma enriquecido com ácido hialurónico. Lubrifica as superfícies e nutre a cartilagem articular. A sua análise é útil no diagnóstico das doenças articulares.

- Osteoblasto: superfície, basófilo, segrega osteoide e controla a mineralização (fosfatase alcalina); produz RANKL e osteoprotegerina. - Osteócito: em lacuna, prolongamentos em canalículos unidos por junções comunicantes. - Osteoclasto: gigante multinucleado da linhagem monócito-macrófago, em lacuna de Howship; bordadura franjada, zona selante, H^{+} e catepsina K. PTH estimula (via células osteoblásticas e osteócitos), calcitonina inibe. - Sistema de Havers: lamelas concêntricas à volta do canal de Havers; canais de Volkmann transversais, sem lamelas. - Intramembranosa: sem cartilagem (abóbada craniana, maior parte da mandíbula). Endocondral: molde de cartilagem hialina (ossos longos). - Cartilagem de conjugação: repouso, proliferação (seriada), hipertrofia, calcificação, ossificação.

7.1. Osso seco humano, corte transversal

O osso foi macerado, seco e desgastado até obter uma lâmina fina. O processamento não preserva o conteúdo celular, mas conserva a arquitetura da matriz óssea mineralizada, incluindo as lamelas; não equivale à remoção de toda a matriz orgânica. As cavidades podem aparecer escuras por um efeito ótico associado ao ar ou ao meio de montagem. Observam-se:

• orifícios arredondados, os canais de Havers, que continham vasos, rodeados por lamelas concêntricas: sistemas de Havers;
• entre eles, lamelas incompletas que já não rodeiam canais: sistemas intermediários;
• lacunas onde estavam os osteócitos, ligadas umas às outras por canalículos finos.

7.2. Maxilar de rato, H&E: osteoclastos e osso imaturo

7.3. Joelho de rato, H&E: ossificação endocondral e membrana sinovial

Entre a epífise (osso trabecular revestido por cartilagem articular) e a diáfise da tíbia, observar a cartilagem de conjugação, com as zonas sucessivas: cartilagem hialina (junto à epífise), cartilagem seriada (condrócitos em fiadas paralelas), cartilagem hipertrofiada (células muito grandes em fiadas) e zona de erosão (lacunas vazias e rompidas, invadidas por vasos que trazem as células osteoformadoras), seguida de osso trabecular imaturo. O osso maduro tem osso compacto na periferia e esponjoso no centro, com medula óssea vermelha.

A membrana sinovial limita lateralmente a cavidade articular: uma a três camadas de células de núcleo escuro sobre conjuntivo laxo muito vascularizado. Por fora, a cápsula fibrosa. Na maioria dos cortes vê-se também a rótula e o tendão rotuliano.

7.4. Joelho de rato, Fast Green e safranina O

A safranina O tem grande afinidade para os proteoglicanos e cora a cartilagem de vermelho, sobre um fundo verde. Evidencia a cartilagem articular e a cartilagem de conjugação entre a epífise e a diáfise. Observam-se também a membrana sinovial, a cápsula fibrosa, a rótula, o ligamento rotuliano e, na maioria das preparações, os ligamentos cruzados ou os meniscos.

7.5. Fratura óssea de rato

A preparação mostra ossificação endocondral durante a reparação de uma fratura. No calo há condrócitos em hipertrofia e regiões de calcificação da matriz cartilagínea. Após a degeneração de muitos condrócitos, a invasão vascular é acompanhada por células osteoprogenitoras; os osteoblastos depositam osteoide sobre septos de cartilagem calcificada, originando trabéculas mistas e osso primário. O calo é progressivamente remodelado. Fragmentos preexistentes podem apresentar lacunas sem conteúdo celular identificável, compatíveis com necrose no contexto da fratura; a ausência de um núcleo num corte isolado não prova, por si só, a morte do osteócito.